Reinigung und Fraktionierung von Phycobiliproteinen aus Arthrospira platensis und Corallina officinalis mit Bewertung ihrer biologischen Aktivitäten

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14270 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Phycobiliproteine (PBPs) sind eine Klasse wasserlöslicher Pigmente mit einer Vielzahl biologischer Funktionen, die in roten Makroalgen und Cyanobakterienarten vorkommen. Die Rohformen von Phycocyanin (C-PC) aus der Blaualge Arthrospira platensis und Allophycocyanin (APC) aus der roten Makroalge Corallina officinalis wurden durch Ammoniumsulfatfällung, Anionenaustauschchromatographie bzw. Größenausschlusschromatographie extrahiert und gereinigt. Die aus A. platensis und C. officinalis erhaltenen C-PC- und APC-Werte betrugen 0,31 mg/ml bzw. 0,08 mg/ml, wobei die Molekularmassen „17,0 KDa und 19,0 KDa“ und „15,0 KDa und 17,0 KDa“ α entsprachen bzw. β-Untereinheiten. Zur Charakterisierung der gereinigten APC und C-PC wurde FT-IR verwendet, um deren Strukturen zu untersuchen. Aus den Subtraktionen PC3 und PC4 wurden hochreine Extrakte (A620/A280 > 4,0) erhalten, die auf ihre biologischen Aktivitäten getestet wurden. APC- und C-PC-Rohextrakte sowie ihre Fraktionen zeigten unter Verwendung von drei Techniken starke Antioxidantien in unterschiedlichen Verhältnissen. PC1 zeigte hohe entzündungshemmende (75,99 und 74,55 %) und antiarthritische (78,89 und 76,92 %) Aktivitäten für C. officinalis und A. platensis im Vergleich zu Standardmedikamenten (72,02 und 71,5 %). Die methanolischen und wässrigen Extrakte beider Arten zeigten eine größere antibakterielle Wirksamkeit gegen Gram+ve als gegen Gram−ve Meeresbakterien. Unsere Studie beleuchtet die potenziellen medizinischen Verwendungsmöglichkeiten von C-PC und APC, die aus den getesteten Arten gewonnen wurden, als natürliche Substanzen in einer Vielzahl von Lebensmitteln und Arzneimitteln. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die vielfältige chemische Natur verschiedener PBPs aus verschiedenen Cyanobakterien und Rotalgen zu untersuchen, da ihre Aminosäuresequenzen zwischen verschiedenen Algenarten variieren.

Cyanophyten-, Kryptophyten-, Cyanellen- und Rhodophytenarten verfügen über Phycobilisomen (PBS), die als Antennen des photosynthetischen Pigmentapparats fungieren. Phycobilisomen enthalten mehrere Phycobiliproteine (PBPs), eine Kategorie proteinhaltiger Zusatzpigmente, die es diesen Algenarten ermöglichen, Lichtenergie außerhalb der von Chlorophyll und Carotinoiden absorbierten Wellenlängen zu sammeln, und für etwa 50 % der Lichteinfangung von Cyanobakterien und Rotalgen verantwortlich sind1. Diese stark gefärbten wasserlöslichen Proteine tragen 30–50 % zur gesamten Lichtsammelkapazität dieser Biotas bei, indem sie Licht im sichtbaren Bereich von 450–650 nm absorbieren, während Chlorophyll in diesem Bereich schlecht absorbiert. Anschließend übertragen sie die Energie auf die Protein-Chlorophyll-Komplexe des Photosystems 2 in den Photosyntheselamellen2.

Es sind über zehn verschiedene PBPs bekannt, die anhand der Wellenlänge und des Vorhandenseins verschiedener Chromophore in vier Gruppen eingeteilt werden können: Phycoerythrine (PEs) haben einen Peak bei 545–566 nm; Phycoerythrocyanine bei 480–580 nm; Phycocyanine (PCs) bei 569–645 nm; und Allophycocyanine (APCs) bei 540–671 nm3. Die Häufigkeit von PBPs ist sehr hoch (ungefähr 40–60 % des gesamten Proteingehalts und 20 % des Trockengewichts der Cyanobakterien)4. PBPs (PE, PC und APC) variieren je nach taxonomischer Position und Kulturbedingungen2. Die Phycobiliproteine bestehen aus unterschiedlichen α- und β-Polypeptid-Untereinheiten5. Cyanobakterien und Rotalgenarten sind die Hauptalgen, die für die kommerzielle Produktion von Phycobiliproteinen verwendet werden, die als Farbstoffe, Fluoreszenzmarker und Diagnosewerkzeuge verwendet werden6. Die Extraktionsmethode für Phycobiliproteine umfasst den Zellaufschluss, um die Proteine aus dem Inneren der Algenzelle nach außen freizusetzen. Während die Zellwände von Cyanobakterien unglaublich widerstandsfähig sind, sind die von Kryptophyten sehr anfällig für Störungen7. Insbesondere die Extraktion von Phycocyanin ist aufgrund der dicken Zellwände und des hohen Schadstoffgehalts eine Herausforderung8. Aufgrund ihrer antoxidativen, antitumoralen und fotosensibilisierenden Eigenschaften sowie ihrer Nützlichkeit als Fluoreszenzmarker haben PBPs in letzter Zeit großes Interesse in den biotechnologischen Bereichen Lebensmittel und Medizin geweckt3,9. Die Pharmaindustrie ist stärker an der PBP-Forschung für medizinische Anwendungen interessiert. Basierend auf dem Bericht von Future Market Insights hatte der PBP-Markt im Jahr 2018 einen Wert von 112,3 Millionen US-Dollar und wird sich bis 2028 voraussichtlich verdoppeln10. Sowohl C-PC als auch APC wurden möglicherweise als starke Antioxidantien gegen freie Radikale beschrieben hängen mit ihren Proteineinheiten zusammen, die für den Prozess des Abfangens freier Radikale entscheidend sind11. Insbesondere wird C-PC aufgrund seiner hepatoprotektiven, antioxidativen, freien Radikalfänger-, entzündungshemmenden, antiarthritischen und antitumoralen Aktivitäten sowie seiner Fluoreszenzmarkierung in der biomedizinischen Forschung als natürliches Protein in der Lebensmittel- und biomedizinischen Forschung verwendet12. Kommerziell wird C-PC unter Verwendung von Cyanobakterienstämmen wie A. platensis13 hergestellt. Mehreren Studien zufolge erzeugt A. platensis neben APC und Spurenkonzentrationen von PE14 PC als primäres Pigment. Wirtschaftliche Anwendungen von C-PC hängen hauptsächlich von seiner Reinheit ab, die normalerweise mit anderen photosynthetischen Proteinen, insbesondere APC12, verunreinigt ist. Darüber hinaus werden APCs häufig als fluoreszierende Proteinsonden in biochemischen Verfahren eingesetzt, insbesondere in der Durchflusszytometrie15,16. APCs haben viele biotechnologische Anwendungen, darunter Antioxidantien17 und Antiviren18. Obwohl APC ein hilfreiches Protein ist, ist seine Verwendung durch die Schwierigkeiten bei der Reinigung großer Mengen des Proteins etwas eingeschränkt. Aufgrund der geringen Konzentration von APC in Cyanobakterien und Makroalgen, die die Trennung und Reinigung in erheblichen Mengen zu einer anspruchsvollen Arbeit macht, legen wir besonderen Wert auf die Reinigung von APC aus C. officinalis. Die Ziele dieser Studie bestanden darin, die dominanten Phycobiliproteine in zwei verschiedenen Algenarten zu identifizieren: Corallina officinalis aus Rhodophyta (APC) und Arthrospira platensis aus Cyanophyta (C-PC). Zusätzlich zur Bewertung der antioxidativen, entzündungshemmenden, antiarthritischen und antibakteriellen Aktivitäten jeder Fraktion in vitro.

Die Reinigung von Phycobiliproteinen aus A. platensis und C. officinalis wurde im Hinblick auf maximale Rückgewinnung und Reinheit optimiert, die den Reinigungsgrad für jedes Protein angeben (Tabelle 1). Beide Phycobiliproteine wurden durch drei aufeinanderfolgende Reinigungsschritte gereinigt, einschließlich Ammoniumsulfatfällung, Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Zellulosesäulen und Größenausschlusschromatographie unter Verwendung von Sephadex G100-Säulen. Es wurde festgestellt, dass der Reinheitsindex jedes Proteins für C-PC aus A. platensis von 0,87 auf 5,64 und für APC aus C. officinalis von 0,49 auf 5,51 anstieg (Tabelle 1). Die Ausfällung roher Phycobiliproteine mit einer Sättigung von 65 % Ammoniumsulfat ergab eine Reinheit von 2,56 bzw. 2,23 für die erhaltenen Niederschläge von A. platensis und C. officinalis, mit einem leichten Anstieg des Reinheitsindex nach der Dialyse für beide Phycobiliproteine (2,91 bzw. 2,91). 2.38). Während der chromatographischen Reinigung wurden sowohl C-PC als auch APC effizient durch Anionenaustauschchromatographie (DEAE-Cellulose) mit einem pH-Gradienten von 3,8 bis 5,6 getrennt, um einen Hauptelutionspeak mit Phycobiliproteinen zu erhalten, dessen Reinheitsverhältnis 3,48 und 2,62 für die gereinigte Substanz erreichte C-PC bzw. APC (Abb. 1). Nach dem Schritt der Anionenaustauschchromatographie erreichten die Gesamtausbeuten von A. platensis C-PC und C. officinalis APC 51,28 % bzw. 56,89 % aus den Ausgangsrohextrakten, was 2,66 bzw. 0,787 mg/ml entspricht (Tabelle 1). Den Absorptionsspektren zufolge zeigte sich eine maximale Absorption bei 620 nm und 650 nm für die gereinigten Phycobiliproteine von A. platensis bzw. C. officinalis. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Phycobiliprotein-Typen C-PC- und APC-Charakter aus A. platensis bzw. C. officinalis haben (Abb. 2A und B). Es wurde festgestellt, dass die Reinigung von C-PC und APC nach jedem Reinigungsschritt verbessert wurde (Abb. 2). Vom Rohextrakt bis zu gereinigten Phycobiliproteinen wurde die Reinheit um fast das Sechsfache erhöht, was die Effizienz der Methode zur Gewinnung von hochreinem C-PC und APC zeigt. Darüber hinaus zeigten während der größenausschlusschromatographischen Trennung sowohl C-PC- als auch APC-Proteine eine maximale Reinheit von 5,64 bzw. 5,51. Die Gesamtausbeute an C-PC und APC nach Größenausschlusschromatographie erreichte 41,8 % bzw. 40,72 %, was 3,20 bzw. 0,85 mg/ml entspricht (Tabelle 1). Die SDS-PAGE-Ergebnisse des gereinigten C-PC aus A. platensis zeigten zwei Banden von 17,0 KDa und 19,0 KDa, die jeweils den α- und β-Untereinheiten entsprachen (Abb. 3A). Während das gereinigte APC aus C. officinalis zwei Banden von 15,0 KDa und 17,0 KDa aufwies, die den α- bzw. β-Untereinheiten entsprachen (Abb. 3B).

Elutionsprofilkurve von C-PC aus A. platensis (A) und APC aus C. officinalis (B) durch Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Acetatpuffer im pH-Bereich von 3,8–5,6.

Absorptionsspektren von Phycobiliproteinen bei jedem Reinigungsschritt. (A) UV-sichtbares Absorptionsspektrum von C-Phycocyanin aus A. platensis während der Trennungs- und Reinigungsschritte. (B) UV-sichtbares Absorptionsspektrum von Allophycocyanin aus C. officinalis während der Trennungs- und Reinigungsschritte.

12 % SDS-PAGE-Analyse der gereinigten Phycobiliproteine während der Reinigungsschritte. (A) SDS-PAGE-Analyse des gereinigten Phycocyanins aus A. Platensis; Spur 1 ist ein Protein-Molekulargewichtsmarker, Spur 2 ist der Auslass der CM-Sephadex-Säule, Spur 3 ist das von der CM-Sephadex-Säule eluierte Phycocyanin und Spur 4 ist das von der CM-Sephadex-Säule eluierte gereinigte Phycocyanin (B) SDS-PAGE-Analyse des gereinigten Allophycocyanins C Officinalis Spur 1 ist ein Protein-Molekulargewichtsmarker, Spur 2 ist der Auslass der CM-Sephadex-Säule, Spur 3 ist das von der CM-Sephadex-Säule eluierte Allophycocyanin und Spur 4 ist das gereinigte Allophycocyanin, das von der CM-Sephadex-Säule eluiert wurde.

Der Reinheitsgrad der extrahierten und gereinigten PBPs war je nach Algenart und Reinigungsgrad unterschiedlich. Das Reinheitsverhältnis der extrahierten PBPs ist eine wesentliche Eigenschaft für bestimmte Anwendungen (Tabelle 1). Laut Rito-Palomares et al.19 gelten Phycocyaninpräparate mit einem A620/A280-Verhältnis gleich oder größer als 0,7 als Lebensmittelqualität, solche mit einem A620/A280-Verhältnis zwischen 0,7 und 3,9 gelten als reaktiv und solche mit einem A620/ A280 größer als 4,0 haben analytische Qualität und pharmazeutische Qualität und reichen aus, um die Anforderungen einer bestimmten Anwendung zu erfüllen. Der Reinheitsgrad aller Proben wurde für eine bestimmte Anwendung empfohlen, mit Ausnahme des rohen APC (0,49 %), wodurch es als Zusatzstoffquelle für gesunde Lebensmittel geeignet ist20,21. Das zuvor untersuchte A620/A280-Verhältnis von reinem C-PC für A. platensis betrug 5,59, 6,69 und 4,9822.

Abbildung 4 zeigt die FT-IR-Analyse des gereinigten C-PC von A. platensis (Abb. 4A) und des gereinigten APC von C. officinalis (Abb. 4B) und zeigt die proteinspezifische Amid-I-Bande bei 1635/cm für C -PC und bei 1631/cm (C=O-Streckung) und Amid II bei 1540/cm für C-PC und 1528/cm für APC. Unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Studien überein, die zeigten, dass die Proteine Amid I und Amid II Schwingungsbanden bei 1650/cm bzw. 1645/cm aufwiesen23,24. Die Position und Form der Amid-I-Bande werden zur Untersuchung der Sekundärstruktur von Proteinen verwendet. Die scharfe Amid-I-Bande sowohl für C-PC als auch für APC spiegelt die a-Helix als gemeinsames Element ihrer sekundären Konformationsstruktur wider. Darüber hinaus bestätigte die FTIR-Analyse des gereinigten C-PC und APC ihre Reinheit durch das Fehlen von Phosphaten und anorganischen Sulfaten (was intensive Banden bei 985/cm und 1061/cm darstellt).

FTIR-Spektrum von (A) Phycocyanin, gereinigt aus A. Platensis, und (B) Allophycocyanin, gereinigt aus C. officinalis.

Phycobiliproteine erfreuen sich aufgrund ihrer hochkonservierten strukturellen und physikalisch-chemischen Eigenschaften sowie ihres Potenzials als Antioxidans, entzündungshemmende Mittel und immunstimulierende Eigenschaften zunehmender Beliebtheit5.

Die antioxidative Fähigkeit beider Algenarten, des extrahierten C-PC und APC und ihrer Fraktionen wurde in vitro mithilfe von drei Techniken bewertet, wie in Abb. 5 dargestellt. Im Allgemeinen war die antioxidative Aktivität der methanolischen Algenextrakte höher der gereinigten und fraktionierten C-PC- und APC-Extrakte in allen getesteten Tests. Diese Abweichung kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass beide getesteten Arten unterschiedliche bioaktive Verbindungen wie Polysaccharide, Phenolverbindungen und Fettsäuren enthalten21,25.

Antioxidative Aktivität von A. platensis C-PC und C. officinalis APC und ihren Fraktionen unter Verwendung verschiedener Tests.

Es gibt erhebliche Schwankungen beim prozentualen Abfangen von DPPH-Radikalen durch gereinigtes und fraktioniertes C-PC und APC aus beiden Algenarten, was darauf hindeutet, dass die getesteten Proben Elektronendonoren waren und mit den freien Radikalen reagieren und diese in stabilere Verbindungen umwandeln konnten, um sie zu terminieren die radikale Kettenwechselwirkung. PBPs sind natürliche Fänger freier Radikale, wie aus zahlreichen Studien26,27,28 hervorgeht, die sowohl vom primären als auch vom sekundären Weg abhängen, indem sie das Metallion chelatisieren, das ROS erzeugt28. Darüber hinaus beeinflussen die Menge und der Ort der Aminosäuren die Fähigkeit der PBPs, als Antioxidans zu wirken11.

Fraktion 1 (F1) zeigte bei den getesteten Spezies eine höhere Abfangaktivität als Rohöl und die anderen beiden Fraktionen sowie der Standard (Ascorbinsäure). Die Ergebnisse zeigten, dass das durch Ammoniumsulfat-Fällungsextrakte gereinigte F1 möglicherweise einige Verbindungen mit einer besseren DPPH- und H2O2-Fängung aufweist. Die IC50-Werte des methanolischen Extrakts von A. platensis und C. officinalis (604,20 und 778,61 µg/ml), der rohen methanolischen C-PC- und ACP-Extrakte (629,94 und 893,39 µg/ml) und des F1 (613,15 und 850,0 µg/ml). ) waren niedriger als der IC50 von Ascorbinsäure 974,39 µg/ml. Dies spiegelte sich auch in den ausgewerteten IC50-Werten wider, die hochsignifikante Unterschiede zu denen des Standardarzneimittels (Ascorbinsäure) (974,39 µg/ml) aufwiesen.

Beide Algenarten und ihre Phycobiliproteinproben zeigten vergleichbare antioxidative Gesamtkapazitäten. Die ermittelten Daten stimmten mit denen von Sonani et al.27 überein, die die antioxidative Wirkung von PC, PE und APC aus dem marinen Cyanobakterium Lyngbya sp. A09DM wurde gleichermaßen durch chelatbildende Aktivität und reduzierende Aktivität beigetragen. Darüber hinaus erzeugten verschiedene Cyanobakterienarten verschiedene Phycobiliprotein-Extrakte mit unterschiedlicher antioxidativer Wirksamkeit29. Cherdkiatikul und Suwanwong11 stellten fest, dass APC eine größere Peroxylradikalfängeraktivität als C-PC aufwies, wohingegen C-PC eine größere Hydroxylradikalfängeraktivität als APC aufwies.

In letzter Zeit haben entzündungshemmende Medikamente, die aus natürlichen Substanzen auf Meeresbasis hergestellt werden, große Aufmerksamkeit erhalten12. Lipoxygenase-Enzyme katalysieren die Umwandlung von Arachidonsäure in Hydroperoxy-Eicosatetraensäuren (HPETEs), die dann zu Monohydroxy-Eicosatetraensäuren (Mono-HETEs) oder (DiHETEs) und Leukotrienen reduziert werden; Diese gelten als einer der stärksten natürlichen Überempfindlichkeits- und Entzündungsmediatoren30.

Wie in Tabelle 2 gezeigt, zeigten die methanolischen Algenextrakte und das C-PC- und APC-Rohöl sowie deren Fraktionen von jeder Art eine entzündungshemmende Aktivität. Die prozentuale Hemmaktivität gegen 15-Lipoxygenase durch den Algenmethanolextrakt und die roh extrahierten PBPs war im Vergleich zu Ascorbinsäure höher als bei den gereinigten Fraktionen. Die selektive entzündungshemmende Aktivität der extrahierten Pigmente könnte auf viele Faktoren zurückzuführen sein, darunter die Verringerung des Lipopolysaccharidspiegels (LPS), die Hemmung der Expression von NF-κB, die Unterdrückung der Apoptose, die Verringerung der Autoimmunreaktion und die Hemmung der Cyclooxygenase-Aktivität (COX-2). Myeloperoxidase-Aktivität und damit die Aktivierung von Makrophagen31. Darüber hinaus könnten die Fängereigenschaften von PBPs gegenüber sauerstoffreaktiven Spezies und ihre hemmende Wirkung auf die COX-2-Aktivität die Ursache für ihre entzündungshemmende Wirkung sein32. In diesem Zusammenhang zeigten Ferreira et al.33 die Rolle von C-PC bei der entzündungshemmenden und antioxidativen Wirkung. C-PC, eine aus A. platensis isolierte Substanz, hat nachweislich entzündungshemmende und antioxidative Wirkungen34. Die Variation der entzündungshemmenden Aktivität kann mit der Auswirkung des Reinigungsprozesses auf die Natur von Phycobiliproteinen zusammenhängen, bei denen es sich in der Natur um Proteine handelt und die von einer Vielzahl von Faktoren beeinflusst werden, wie z. B. dem Extraktionsprozess, der Temperatur, den chemischen Typen und dem Verhältnis29.

Darüber hinaus betrugen die geschätzten IC50-Werte 670,73, 668,33, 658,01, 675,56 und 799,74 µg/ml für C. officinalis, Roh-APC, F1, F2 und F3, verglichen mit Diclofenac bei 689,46 µg/ml. Während die ausgewerteten IC50-Werte für den methanolischen Extrakt von A. platensis, C-PC, F1, F2 und F3 663,6, 671,2, 670,73, 699,78 und 737,25 µg/ml betrugen. Diese Ergebnisse zeigten, dass die entzündungshemmende Wirkung nicht nur je nach Algenart, sondern auch je nach Struktur des extrahierten Phycocyanins und seiner Fraktionen unterschiedlich ist.

Im Hinblick auf die Antidenaturierungsaktivität der getesteten Algen und ihrer extrahierten Phycobiliproteinfraktionen (Tabelle 2) wurde die Antidenaturierungsfähigkeit verwendet, um ihre Fähigkeit zu testen, die Produktion von Autoantigenen zu kontrollieren und dadurch die Denaturierung von Proteinen im Vergleich zu Diclofenac zu hemmen Natrium als Standardmedikament, wobei die Hauptursache für rheumatoide Arthritis die Denaturierung von Proteinen und die Produktion von Autoantigenen ist35. Im Gegensatz zum Medikament Diclofenac-Natrium zeigten die Proben ihr Potenzial, die Synthese von Autoantigenen zu begrenzen und folglich die Denaturierung von Proteinen zu hemmen, die ein wesentlicher Faktor für rheumatoide Arthritis ist35. Es zeigte sich, dass die methanolischen Algenextrakte und das rohe C-PC und APC beider getesteten Arten eine höhere antiarthritische Aktivität aufwiesen als Fraktionen. Die methanolischen Extrakte von C. officinalis und A. platensis enthielten verschiedene bioaktive Substanzen mit Antidenaturierungsaktivität21,36.

Die bewerteten IC50 waren in der folgenden Reihenfolge C. officinalis methanolischer Extrakt (571,43 µg/ml), A. platensis (579,24 µg/ml), C-PC (638,98 µg/ml) und APC (649,52 µg/ml). wurden signifikant mit dem Diclofenac-Wert (699,3 µg/ml) verglichen. Die antiarthritischen Wirkungen von PBPs könnten auf ihre Fähigkeit zurückzuführen sein, ROS abzufangen, sowie auf ihre Effizienz bei der Blockierung des Metabolismus von Arachidonsäure und der Bildung von Zytokinen wie dem Tumornekrosefaktor (TNF)37.

In dieser Studie untersuchten wir die antimikrobielle Wirkung der getesteten Algen und ihrer PBPs-Fraktionen gegen marine pathogene Bakterien durch Trübungsmessung unter sterilen Laborbedingungen. Es wurde festgestellt, dass die methanolischen Algenextrakte und rohen PBPs beider getesteter Arten eine höhere antibakterielle Aktivität aufwiesen als PBPs-Fraktionen (Tabelle 3). Während die methanolischen Extrakte von C. officinalis und A. platensis unterschiedliche bioaktive Substanzen enthielten, die das Bakterienwachstum je nach Extraktquelle, Extraktionslösungsmittel und Konzentration des Pigments im Extrakt sowie dem getesteten Meerwasser unterschiedlich stark hemmen Krankheitserreger, wie in früheren Studien gezeigt36,38. Die antimikrobielle Aktivität von PBPs hing von der Proteinnatur dieser Pigmente und den hydrophoben Eigenschaften ihres Aminosäuregehalts ab39. Die Ergebnisse zeigten, dass methanolische Algenextrakte und rohe PBPs der beiden getesteten Arten eine höhere antibakterielle Aktivität gegen grampositive Meeresbakterien aufwiesen als grampositive Arten. Die Resistenz der Gram-ve-Bakterien kann auf ihre äußere Membranstruktur oder auf das Vorhandensein von Resistenzgenen und DNA von anderen Resistenzstämmen oder auf genetische Veränderungen in der DNA zurückzuführen sein, die die Proteinproduktion verändern und zu Rezeptoren führen können, die das erkennen Antibiotika40. In diesem Zusammenhang wies Gentscheva41 darauf hin, dass Methanol, Ethanol und wässrige Extrakte von A. platensis eine antimikrobielle Wirkung gegen vier verschiedene Arten von grampositiven Bakterien haben, nämlich S. aureus, S. pneumonia, B. cereus, E. faecalis, Nr Die antimikrobielle Aktivität des methanolischen Extrakts führt zu positiven Ergebnissen bei S. pneumonia und B. cereus. Außerdem berichtete Kovaleski42 über die antimikrobielle Aktivität der extrahierten PBPs aus Rotalgen, und Safari4 berichtete über die hemmende Aktivität von C-PC aus A. platensis auf S. aureus.

Die Phycobiliproteine von Rotalgen und Cyanobakterien sind wertvolle Nebenprodukte proteinhaltiger Pigmente mit einer Vielzahl wirtschaftlicher Anwendungen. Aufgrund ihrer wohltuenden Wirkung ist es in letzter Zeit immer wichtiger geworden, synthetische Farben zu ersetzen. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen deutlich, dass das rohe C-PC und APC und ihre Fraktionen aus A. platensis und C. officinalis in vitro hohe biologische Aktivitäten aufwiesen, einschließlich antioxidativer, entzündungshemmender und antiarthritischer Aktivität antimikrobielle Aktivitäten, mit unterschiedlichen Verhältnissen je nach Algenart und Reinigungsgrad. Diese Erkenntnisse liefern die Referenzdaten des Pigments, die in der Lebensmittel-, Arzneimittel- und Kosmetikindustrie verwendet werden können. Zukünftige Studien sollten auf die Verbesserung der PBP-Produktion und auch auf die Verbesserung ihrer biologischen Aktivitäten ausgerichtet sein.

Arthrospira (Spirulina) platensis (Geitler) aus Cyanophyceae wurde aus dem Meerwasser des Eastern Harbour in Alexandria, Ägypten, isoliert, dann isoliert und im Labor auf Zarrouk-Medium kultiviert43. Die Identifizierung der Art erfolgte gemäß Desikachary44 und der Algae Base-Website45. Die Kultur von A. platensis wurde bei 30 °C unter 12:12/Hell-Dunkel-Zyklen und einer Lichtintensität von 40 μE/m2/s inkubiert. Anschließend wurde im stationären Stadium (nach 12 Tagen) durch 20-minütige Zentrifugation bei 4500 × g geerntet und die erhaltene Biomasse gründlich mit entionisiertem Wasser gewaschen, um anhaftende Salze zu entfernen. Abschließend wurde das Pellet bei 60 °C bis zu einem konstanten Gewicht gefriergetrocknet und dann zur weiteren Analyse in einem Glasfläschchen im Kühlschrank bei –20 °C gelagert.

Frische Corallina officinalis Linnaeus von Rhodophyceae wurde während der Sommersaison 2021 handverlesen an der felsigen Küste entlang des Osthafens (Längengrade 29,88°–29,90° E und Breitengrade 31,20°–31,22° N) gepflückt. Die gesammelte Probe wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend mit einer weichen Bürste gereinigt, um Epiphyten und Fremdstoffe zu entfernen. Am selben Tag der Sammlung wurden einige der gesammelten Algen zur taxonomischen Identifizierung gemäß Aleem46 in Formalin (5 %) in Meerwasser konserviert und anschließend auf der Algae Base-Website45 bestätigt. Ein Teil des sauberen Thallus wurde bei Raumtemperatur (27 ± 2 °C) auf saugfähigem Papier bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet, dann zu feinem Pulver gemahlen und für weitere Verwendungen bei –20 °C gelagert.

Etwa ein Gramm jeder getrockneten Biomasse wurde in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,8, als Arbeitspuffer (WB) resuspendiert und beide suspendierten Biomassen wurden durch Ultraschallbehandlung für 60 s aufgeschlossen. Anschließend wurde die Extraktion der Phycobiliproteine von A. platensis und C. officinalis in WB durch wiederholtes Einfrieren bei –20 °C und Auftauen bei Raumtemperatur im Dunkeln einmal täglich für 4 Tage durchgeführt, bis die Zellextrakte dunkelblau wurden. Anschließend wurden die Phycobiliproteinmischungen von A. platensis und C. officinalis 30 Minuten lang bei 4 ° C und 10.000 × g zentrifugiert und der klare Überstand gesammelt. Die Absorption jeder Extraktion wurde bei 562, 620 und 652 nm gegen WB als Blindreferenz zur Berechnung der Konzentrationen von C-Phycocyanin (C-PC), Allophycocyanin (APC) und Phycoerythrin (PE) gemessen47,48. Zur Reinigung der Phycobiliproteine von A. platensis und C. officinalis wurde der Rohextrakt jeder Biomasse durch langsame Zugabe von 65 % Ammoniumsulfat unter kontinuierlichem Rühren ausgefällt, um eine 65 %ige Sättigung mit Ammoniumsulfat zu erreichen. Nachdem jede Lösung 12 Stunden lang in einem Kühlraum stehengelassen wurde, wurde jede Lösung 10 Minuten lang bei 4500 × g zentrifugiert und jedes Pellet in dem kleinen Volumen WB resuspendiert und 3 Tage lang gegen das Zehnfache des Volumens WB49 dialysiert. Die erhaltenen dialysierten Lösungen wurden separat auf eine mit WB voräquilibrierte DEAE-Cellulose-Säule aufgetragen und mit Acetatpuffer mit einem pH-Wert im Bereich von 3,8 bis 5,6 eluiert, um die Säule mit einer Flussrate von 20 ml/h zu entwickeln49. Alle Phycobiliproteine enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und durch Ultrafiltration mit einem Cut-off von 3 KDa (Millipore, Merk, USA) konzentriert und auf eine mit WB äquilibrierte Sephadex G100-Säule aufgetragen. Das Phycobiliprotein für jedes A.-platensis- und C.-officinalis-Phycobiliprotein wurde von einer Sephadex-G100-Säule mit einer Flussrate von 0,5 ml/min unter Verwendung von WB mit 0,15 M NaCl eluiert. Sowohl gereinigte Rotalgen als auch Cyanobakterien-Phycobiliproteine wurden während jedes Reinigungsschritts charakterisiert und durch Absorptionsspektroskopie durch Scannen der Fraktionen in einem Bereich von 260–750 nm analysiert. Die Reinheit der einzelnen Phycobiliproteine aus A. platensis und C. officinalis wurde bei jedem Reinigungsschritt anhand der Absorptionsverhältnisse von A620/A280 und A650/A280 für C-PC bzw. APC berechnet50. Die Reinheit und Homogenität jedes Algen-C-PC und -APC wurden durch 12 % SDS-PAGE mit mittlerer Proteinleiter (15–240 Mw) analysiert. Alle Fraktionen, die das gereinigte C-PC oder APC enthalten, wurden gepoolt, dialysiert, lyophilisiert und bis zur weiteren Verwendung bei –20 °C aufbewahrt. Darüber hinaus wurden das gereinigte C-PC und APC durch FTIR (Shimadzu FT-IR-8400 S, Japan) charakterisiert.

Die antioxidative Aktivität der ausgewählten Algen und der extrahierten Phycobiliproteine (1000 µg/ml) wurde in methanolischen Extrakten unter Verwendung von drei Standardmethoden bestimmt.

Die Fähigkeit der getesteten Algen und ihrer Phycocyaninextrakte, freie DPPH-Radikale abzufangen, wurde gemäß der Technik von Tierney et al.51 geschätzt. Die abgefängte DPPH-Fängeraktivität wurde anhand der folgenden Formel berechnet:

Dabei ist AC die Absorption der Kontrolle und AS die Absorption in Gegenwart der Probe oder des Standards.

Konzentrationen einer 50-prozentigen Hemmung (IC50) der DPPH-Radikale wurden mit der GraphPad Prism 6-Software berechnet.

Der TAC der verschiedenen Proben wurde spektrophotometrisch bei 695 nm analysiert. Der nachgewiesene TAC entsprach jedoch dem Ascorbinsäure-Standard (0,5 g/100 ml destilliertes Wasser) und wurde gemäß der Methode von Prieto et al.52 in mg/g Ascorbinsäure-Äquivalent (AsA-Äquivalent) ausgedrückt.

Die H2O2-Fängeraktivität der getesteten Proben und/oder Ascorbinsäure als Kontrolle wurde bei 230 nm nach Gülçin et al.53 bestimmt.

Der Prozentsatz der H2O2-Fängeraktivität wurde anhand der Formel geschätzt:

Die IC50-Werte wurden ebenfalls wie oben beschrieben berechnet.

Der Anti-Lipoxygenase-Aktivitätstest der methanolischen Probenextrakte basierte auf der Messung der Bildung des Komplexes Fe3+/Xylenolorange mit einem Spektrophotometer bei 560 nm54. Das Hemmungsverhältnis wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung unter Verwendung von Quercetin „Standardarzneimittel“ als Standardarzneimittel berechnet.

Dabei ist A-Kontrolle die Extinktion der Kontrolle, A-Leerwert die Extinktion des Blindwerts und A-Probe die Extinktion der Probe.

Die Antidenaturierungsfähigkeit der getesteten Proben wurde mit der Methode von Sakat et al.55 mit geringfügigen Modifikationen ermittelt. Als Positiv- bzw. Negativkontrollen wurden das „handelsübliche Arzneimittel“ Diclofenac-Natrium und destilliertes Wasser verwendet. Der Hemmungsprozentsatz wurde bei 660 nm gemessen und anhand der folgenden Formel geschätzt.

Dabei ist A-Kontrolle die Extinktion der Kontrolle, A-Leerwert die Extinktion des Blindwerts und A-Probe die Extinktion der Probe.

Die getesteten pathogenen gramnegativen Bakterienstämme „Escherichia coli ATCC8739, Vibrio fluvialis ATCC33809, V. fluvialis ATCC33809, Pseudomonas aeruginosa ATCC9027, P. fluoreszenz ATCC13525, Klebsiella pneumonia ATCC13883 und Aeromonas hydrophila ATCC13037“ und der grampositive Bacillus sutli ls ATCC6633, Enterococcus faecalis ATCC29212, Streptococcus agalactiae ATCC13813 und Staphylococcus aureus ATCC25923 wurden vom Marine Microbiology Laboratory, NIOF, Alexandria bezogen.

Unter Verwendung aseptischer Techniken wurde eine einzelne Bakterienkolonie in eine 100-ml-Nährbrühe überführt und über Nacht bei einer Temperatur von 37 °C in einen Inkubator gestellt. Nach 24-stündiger Inkubation wurde die Bakterienbrühe-Kultur 15 Minuten lang bei 6000 U/min zentrifugiert und dann ein sauberes Bakterienpellet hergestellt. Die Brühe wurde unter Anwendung geeigneter aseptischer Vorsichtsmaßnahmen heruntergeschleudert. Der resultierende Überstand wurde in einen beschrifteten Abfallbecher entsorgt. Das resultierende Pellet wurde in 20 ml steriler Kochsalzlösung erneut suspendiert und erneut 15 Minuten lang bei 6000 U/min zentrifugiert. Dieser Schritt wurde viele Male wiederholt, bis der erhaltene Überstand klar wurde. Dann wurde das Pellet in 20 ml steriler Kochsalzlösung suspendiert und als Bs (Brühensuspension) gekennzeichnet. Die optische Bs-Dichte wurde im Wellenbereich von 600 nm aufgezeichnet und es wurden Reihenverdünnungen mit geeigneten aseptischen Methoden durchgeführt, bis die optische Bs-Dichte den Bereich von 0,5–1,0 erreichte. Die tatsächliche Anzahl koloniebildender Einheiten (KBE) wurde anhand des Diagramms der Lebensfähigkeit berechnet und geschätzt. Der erforderliche Verdünnungsfaktor wurde geschätzt und die Reihenverdünnung durchgeführt, um eine Konzentration von 5 × 106 KBE/ml56 zu erreichen.

Beschriftete Reagenzgläser wurden unter aseptischen Bedingungen vorbereitet. 10 μl des Testalgenextrakts, gelöst in 1000 μg/ml (w/v) DMSO-Stammlösung (normalerweise eine Stammkonzentration von 1 mg/ml für gereinigte Verbindungen), Antibiotika (als Positivkontrolle) und nur Nährbrühe (als Negativ). Kontrolle) wurden in 900 μL Nährbrühe enthaltende Reagenzgläser pipettiert. Abschließend wurden jedem Reagenzglas 10 μl Bakteriensuspension zugesetzt, um eine Konzentration von 5 × 106 KBE/ml zu erreichen. Anschließend wurden die erhaltenen Reagenzgläser locker mit Frischhaltefolie umwickelt. Jedes Gestell enthielt Reagenzgläser mit einer Reihe von Kontrollen, einem Breitbandantibiotikum als Positivkontrolle (normalerweise Ciprofloxacin in der gleichen Konzentration wie die Testverbindung für Bakterien und Diclofan für die Hefe), allen Lösungen mit Ausnahme der Testverbindung und Alle Lösungen mit Ausnahme der Bakterienlösung, der 10 μl Nährbrühe zugesetzt wurden56.

Gemäß der Macfarland-Standardmethode ist eine Trübung von 0,5 normalerweise nicht in der Lage, eine KBE-Standardzahl für alle Bakterienstämme zu ergeben, so dass es aufgrund der Unterschiede in der optischen Dichte sehr schwierig ist, zwischen verschiedenen Bakterienarten zu vergleichen. Um eine einheitliche Bakterienzahl verschiedener Arten zu erhalten, muss daher eine Reihe von Abtötungs-/Lebensfähigkeitsdiagrammen für jede Bakterienart erstellt werden. Eine Endkonzentration erreicht 5 × 106 KBE/ml. So konnten verschiedene Bakterienarten und verschiedene Stämme verglichen werden57.

Die erhaltenen Ergebnisse wurden als Mittelwert der Standardabweichung ± (n = 3) ausgedrückt und die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungen wurde mithilfe einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung der Statistiksoftware SPSS 15.0 geschätzt. Unterschiede wurden akzeptiert und bei einem P-Wert < 0,05 als signifikant angesehen.

Alle im Rahmen dieser Studie gewonnenen Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

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Die Autoren danken dem National Institute of Oceanography & Fisheries (NIOF) in Alexandria, Ägypten, für die Bereitstellung aller für die Fertigstellung dieser Arbeit erforderlichen Einrichtungen.

Open-Access-Finanzierung durch die Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) in Zusammenarbeit mit der Egyptian Knowledge Bank (EKB).

Nationales Institut für Ozeanographie und Fischerei, NIOF, Kairo, Ägypten

Mona M. Ismail & Ghada E. Hegazy

Abteilung für Proteinforschung, Forschungsinstitut für Gentechnik und Biotechnologie (GEBRI), Stadt für wissenschaftliche Forschung und technologische Anwendungen, Alexandria, Ägypten

Esmail M. El-Fakharany

Abteilung für Bioprozessentwicklung, Forschungsinstitut für Gentechnik und Biotechnologie (GEBRI), Stadt für wissenschaftliche Forschung und technologische Anwendungen, Alexandria, Ägypten

Ghada E. Hegazy

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MMI, EME & GEH: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, Schreiben-Originalentwurf, Schreiben-Rezension und Bearbeitung.

Korrespondenz mit Mona M. Ismail oder Ghada E. Hegazy.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ismail, MM, El-Fakharany, EM & Hegazy, GE Reinigung und Fraktionierung von Phycobiliproteinen aus Arthrospira platensis und Corallina officinalis mit Bewertung ihrer biologischen Aktivitäten. Sci Rep 13, 14270 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41001-y

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Eingegangen: 10. Februar 2023

Angenommen: 20. August 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41001-y

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